從3個(gè)月到1個(gè)月的極限加速

一條序列的難度，往往不取決于它的長(zhǎng)度，而隱藏在其堿基的排列組合之中。當(dāng)一條序列中充滿(mǎn)了“重復(fù)”的段落，它便成為了合成專(zhuān)家們最棘手的挑戰(zhàn)之一。

今天，我們將分享一個(gè)突破性的成功案例：面對(duì)一條長(zhǎng)度達(dá)9kb，且被分析軟件標(biāo)記為“極端復(fù)雜”的超高重復(fù)基因，我們成功地將傳統(tǒng)需要3個(gè)月的合成周期，縮短至1個(gè)月。

1.一份“極端”復(fù)雜的基因序列

我們收到了客戶(hù)提供的原始序列。經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)分析，報(bào)告上的“Extreme”和“Complex”標(biāo)簽，揭示了其合成難度：

序列長(zhǎng)度約9kb，這本身就是一個(gè)不小的規(guī)模。

最令人望而生畏的是其重復(fù)程度——系統(tǒng)中長(zhǎng)達(dá)20個(gè)堿基的重復(fù)序列（長(zhǎng)重復(fù)）高達(dá)293處，被標(biāo)記為“Extreme”；而9個(gè)堿基的短重復(fù)序列密度也達(dá)到了65.3%，意味著序列中將近三分之二的區(qū)域都遍布著短重復(fù)。

這些數(shù)據(jù)意味著，我們面對(duì)的是一條在結(jié)構(gòu)上“高度自相似”的序列，就像是要拼裝一幅由大量幾乎完全相同的天空碎片組成的巨型拼圖。

2. 從“序列優(yōu)化”到“高效合成”

面對(duì)如此挑戰(zhàn)，我們經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段完成：

第一階段：智能設(shè)計(jì)，從源頭降低難度

我們的首要任務(wù)是對(duì)序列進(jìn)行“精裝修”，但不改變其最終編碼的氨基酸序列。我們利用專(zhuān)有的序列優(yōu)化算法，對(duì)原始序列進(jìn)行了優(yōu)化重構(gòu)：

大幅削減長(zhǎng)重復(fù)：將20nt長(zhǎng)重復(fù)數(shù)量從 293處 顯著降低至 114處 。

優(yōu)化短重復(fù)結(jié)構(gòu)：重組序列，有效分散了短重復(fù)的密度，破壞了其連續(xù)性。

優(yōu)化后的序列，雖然在功能上與原始序列完全一致，但其“可合成性”得到了質(zhì)的提升，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室成功合成鋪平了道路。

第二階段：精準(zhǔn)合成

在優(yōu)化序列的基礎(chǔ)上，我們啟動(dòng)了高效的合成流程。通過(guò)分段合成、精密組裝的策略，結(jié)合嚴(yán)格的多輪質(zhì)控驗(yàn)證，我們確保了在每一個(gè)環(huán)節(jié)的準(zhǔn)確無(wú)誤。最終，我們僅僅用了1個(gè)月成功合成了全長(zhǎng) 9kb 的高重復(fù)基因，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，序列完全正確，無(wú)任何突變或缺失，客戶(hù)可直接用于下游表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

3.“重復(fù)序列”為何是合成噩夢(mèng)

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，重復(fù)序列就是指在DNA鏈上多次出現(xiàn)的、相同或高度相似的堿基模式。它就像一篇文章中反復(fù)出現(xiàn)的、完全相同的長(zhǎng)句或短語(yǔ)。在本案例中，我們主要應(yīng)對(duì)兩種類(lèi)型：

短重復(fù)序列：通常指6-15個(gè)堿基的重復(fù)，它們會(huì)影響DNA合成時(shí)引物的特異性結(jié)合。

長(zhǎng)重復(fù)序列：通常指15個(gè)堿基以上的重復(fù)，它們是基因組裝過(guò)程中最主要的“攪局者”。

為何重復(fù)序列如此難以合成？

• 引物定位錯(cuò)誤，導(dǎo)致PCR失?。涸诤铣蛇^(guò)程中，我們需要利用引物作為“定位器”來(lái)擴(kuò)增或組裝DNA片段。當(dāng)序列中存在大量重復(fù)時(shí)，引物無(wú)法找到唯一的位置進(jìn)行結(jié)合，可能會(huì)錯(cuò)誤地結(jié)合到多個(gè)相似的位點(diǎn)。這會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增出錯(cuò)誤的、長(zhǎng)短不一的產(chǎn)物，甚至完全無(wú)法擴(kuò)增目標(biāo)片段。
• 組裝過(guò)程中的錯(cuò)配：基因合成通常是將短片段像拼圖一樣一步步組裝起來(lái)。如果多個(gè)拼圖碎片看起來(lái)一模一樣，組裝系統(tǒng)就會(huì)“犯糊涂”，無(wú)法判斷哪一塊應(yīng)該拼在哪個(gè)位置。長(zhǎng)重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致DNA片段在組裝時(shí)發(fā)生錯(cuò)配和重組錯(cuò)誤，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)混亂的最終產(chǎn)物。
• 聚合酶的“打滑”現(xiàn)象：DNA聚合酶在復(fù)制重復(fù)序列時(shí)，容易發(fā)生“鏈滑動(dòng)”。它可能在重復(fù)區(qū)域“迷路”，導(dǎo)致堿基的插入或缺失，從而引入突變，使得最終序列與設(shè)計(jì)要求不符。
• 形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)：重復(fù)序列自身容易折疊形成發(fā)夾、莖環(huán)等穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)會(huì)物理性地阻礙合成酶的推進(jìn)，使得合成反應(yīng)效率低下甚至中斷。
• 正是這些因素相互疊加，使得高重復(fù)序列的合成變得舉步維艱，通常需要反復(fù)試錯(cuò)、耗時(shí)漫長(zhǎng)。

4.以技術(shù)實(shí)力，兌現(xiàn)交付承諾

這個(gè)9kb超高重復(fù)基因項(xiàng)目提前交付，不僅僅是一個(gè)速度的紀(jì)錄，更是我們序列設(shè)計(jì)能力、合成平臺(tái)效率與項(xiàng)目執(zhí)行經(jīng)驗(yàn)的集中體現(xiàn)。泓迅生物提供從密碼子優(yōu)化、基因合成到載體構(gòu)建、