RNA干擾——shRNA

RNA干擾（RNAi）是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的序列特異性基因沉默機(jī)制。短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, shRNA）是一種經(jīng)由載體遞送并穩(wěn)定表達(dá)的RNA分子，其可在細(xì)胞內(nèi)被加工成小干擾RNA（siRNA），進(jìn)而引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）降解靶信使RNA（mRNA），從而實(shí)現(xiàn)特異性基因敲低。

Gene silencing by RNAi [1]

為超越單一基因功能研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程的系統(tǒng)性解析，shRNA 文庫(kù)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

什么是shRNA文庫(kù)

單個(gè) shRNA 實(shí)驗(yàn)只能研究一個(gè)特定基因的功能。然而，生物學(xué)中的絕大多數(shù)現(xiàn)象（如細(xì)胞增殖、死亡、分化、癌癥發(fā)生、藥物反應(yīng)等）都不是由單個(gè)基因決定的，而是由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控的。因此，要全面理解這些過(guò)程，就需要一種能夠同時(shí)、系統(tǒng)地干擾大量基因并進(jìn)行篩選的方法。shRNA 文庫(kù)正是為了滿足這種高通量篩選的需求而誕生的。

shRNA 文庫(kù)是一個(gè)經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)生物信息學(xué)設(shè)計(jì)的、包含數(shù)萬(wàn)條獨(dú)特 shRNA 序列的重組慢病毒載體集合。該文庫(kù)旨在靶向基因組中幾乎所有編碼基因，每條 shRNA 序列針對(duì)一個(gè)特定基因的轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)高通量病毒包裝和生產(chǎn)，可獲得滴度均一、覆蓋完整的病毒文庫(kù)池，用于大規(guī)模細(xì)胞轉(zhuǎn)換。2

shRNA文庫(kù)的主要作用

大規(guī)模功能喪失性篩選這是shRNA文庫(kù)最核心、最強(qiáng)大的應(yīng)用。科學(xué)家可以利用文庫(kù)在細(xì)胞水平上回答這樣一個(gè)問(wèn)題：“成千上萬(wàn)個(gè)基因中，哪些基因的沉默會(huì)導(dǎo)致我感興趣的特定表型？”

工作原理：

建庫(kù)與轉(zhuǎn)換：將一個(gè)包含數(shù)萬(wàn)條shRNA序列的病毒文庫(kù)感染到大量細(xì)胞中，確保每個(gè)細(xì)胞只隨機(jī)接收1-2條shRNA，從而形成一個(gè)“每個(gè)基因都被不同程度沉默”的細(xì)胞群體。

施加選擇壓力：給這個(gè)細(xì)胞群體施加特定的選擇條件。

正向篩選：例如，在培養(yǎng)皿中加入一種抗癌藥物，那么那些因某個(gè)基因被沉默而存活下來(lái)（獲得耐藥性）或快速增殖的細(xì)胞就會(huì)被富集。

負(fù)向篩選：例如，尋找對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要的基因，那些因必需基因被沉默而死亡或消失的細(xì)胞會(huì)被淘汰，它們?cè)诤Y選前的群體中含量很高，在篩選后的群體中含量極低。

測(cè)序與比對(duì)：篩選結(jié)束后，提取存活細(xì)胞群的基因組DNA，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析其中shRNA的序列和豐度。

數(shù)據(jù)分析：通過(guò)與篩選前的原始文庫(kù)比對(duì)，找出那些在存活細(xì)胞中被顯著富集或被顯著耗盡的shRNA。這些shRNA所靶向的基因，就與我們所研究的表型（如耐藥性、細(xì)胞存活）密切相關(guān)。

Generation of a pooled shRNA library for functional genomics screens [2]

shRNA文庫(kù)的應(yīng)用領(lǐng)域

01. 發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)或疾病相關(guān)基因

• 癌癥研究：篩選哪些基因的沉默可以使癌細(xì)胞對(duì)化療藥物更敏感，這些基因本身可能就是很好的藥物靶點(diǎn)（如果抑制該蛋白能增強(qiáng)藥效）。
• 病毒感染：篩選宿主細(xì)胞中哪些基因是病毒復(fù)制所必需的，為開(kāi)發(fā)抗病毒藥物提供新思路。
• 疾病機(jī)理：篩選在特定疾病模型（如神經(jīng)退行、代謝疾病）中起關(guān)鍵作用的基因，揭示新的疾病機(jī)制。

02. 合成致死篩選

這是癌癥治療中的一個(gè)重要概念：兩個(gè)基因單獨(dú)突變都不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但同時(shí)突變則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。shRNA文庫(kù)可以用于篩選與已知癌基因（如KRAS, MYC）構(gòu)成“合成致死”關(guān)系的其他基因。這意味著，對(duì)于攜帶特定癌基因突變的癌癥，我們可以設(shè)計(jì)藥物來(lái)靶向與其合成致死的另一個(gè)基因，從而特異性殺死癌細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞。

03. 驗(yàn)證基因功能網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)分析篩選結(jié)果中富集或耗盡的基因集合，可以進(jìn)行生物信息學(xué)分析（如通路富集分析），發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與哪些生物學(xué)通路（如MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路等），從而從系統(tǒng)層面理解調(diào)控某一表型的基因功能網(wǎng)絡(luò)。

shRNA文庫(kù)的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)

• 高通量：一次實(shí)驗(yàn)可篩選數(shù)萬(wàn)個(gè)基因，效率極高。
• 系統(tǒng)性：無(wú)偏見(jiàn)地探索整個(gè)基因組，有可能發(fā)現(xiàn)之前未被注意到的基因。
• 功能直接：直接揭示基因的功能缺失所帶來(lái)的表型，建立“基因-表型”的直接因果關(guān)系。
• 永久沉默：shRNA通過(guò)載體整合到基因組中，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因沉默，適用于需要長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的篩選實(shí)驗(yàn)。

建立shRNA文庫(kù)的根本原因是生物學(xué)問(wèn)題的復(fù)雜性，其核心作用是將RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)化為一種強(qiáng)大的大規(guī)模發(fā)現(xiàn)工具。它使科學(xué)家能夠像進(jìn)行“人口普查”一樣，在全基因組范圍內(nèi)快速、系統(tǒng)地篩選出與特定生命現(xiàn)象或疾病過(guò)程相關(guān)的關(guān)鍵基因，從而極大地加速了功能基因組學(xué)的研究和新藥靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。

泓迅生物——全基因組shRNA文庫(kù)

泓迅生物提供高質(zhì)量定制全基因組shRNA文庫(kù)可為大規(guī)模功能缺失篩選提供高效且經(jīng)濟(jì)的解決方案。shRNA文庫(kù)可以以E.coli菌株、DNA或者病毒的形式交付。

高多樣性: 我們的全基因組shRNA文庫(kù)擁有從數(shù)百至10^6的高度復(fù)雜度。

高覆蓋率、高均一性: 文庫(kù)覆蓋度>90%，且各序列豐度分布均勻，有效保障了全基因組篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性和發(fā)現(xiàn)能力。

高質(zhì)量病毒包裝：可包裝多種病毒系統(tǒng)，周期短、性價(jià)比高。

嚴(yán)格質(zhì)控交付：NGS測(cè)序驗(yàn)證成功后交付。

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Reference

[1] Mohr SE, Smith JA, Shamu CE, Neumüller RA, Perrimon N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Sep;15(9):591-600.

[2] Papadopoulos D, Ade CP, Eilers M. Generation of a pooled shRNA library for functional genomics screens. STAR Protoc. 2022 Feb 15;3(1):101183.