從3個月到1個月的極限加速

一條序列的難度，往往不取決于它的長度，而隱藏在其堿基的排列組合之中。當(dāng)一條序列中充滿了“重復(fù)”的段落，它便成為了合成專家們最棘手的挑戰(zhàn)之一。

今天，我們將分享一個突破性的成功案例：面對一條長度達(dá)9kb，且被分析軟件標(biāo)記為“極端復(fù)雜”的超高重復(fù)基因，我們成功地將傳統(tǒng)需要3個月的合成周期，縮短至1個月。

1.一份“極端”復(fù)雜的基因序列

我們收到了客戶提供的原始序列。經(jīng)過專業(yè)的生物信息學(xué)分析，報告上的“Extreme”和“Complex”標(biāo)簽，揭示了其合成難度：

序列長度約9kb，這本身就是一個不小的規(guī)模。

最令人望而生畏的是其重復(fù)程度——系統(tǒng)中長達(dá)20個堿基的重復(fù)序列（長重復(fù)）高達(dá)293處，被標(biāo)記為“Extreme”；而9個堿基的短重復(fù)序列密度也達(dá)到了65.3%，意味著序列中將近三分之二的區(qū)域都遍布著短重復(fù)。

這些數(shù)據(jù)意味著，我們面對的是一條在結(jié)構(gòu)上“高度自相似”的序列，就像是要拼裝一幅由大量幾乎完全相同的天空碎片組成的巨型拼圖。

2. 從“序列優(yōu)化”到“高效合成”

面對如此挑戰(zhàn)，我們經(jīng)過兩個階段完成：

第一階段：智能設(shè)計，從源頭降低難度

我們的首要任務(wù)是對序列進(jìn)行“精裝修”，但不改變其最終編碼的氨基酸序列。我們利用專有的序列優(yōu)化算法，對原始序列進(jìn)行了優(yōu)化重構(gòu)：

大幅削減長重復(fù)：將20nt長重復(fù)數(shù)量從 293處 顯著降低至 114處 。

優(yōu)化短重復(fù)結(jié)構(gòu)：重組序列，有效分散了短重復(fù)的密度，破壞了其連續(xù)性。

優(yōu)化后的序列，雖然在功能上與原始序列完全一致，但其“可合成性”得到了質(zhì)的提升，為后續(xù)的實驗室成功合成鋪平了道路。

第二階段：精準(zhǔn)合成

在優(yōu)化序列的基礎(chǔ)上，我們啟動了高效的合成流程。通過分段合成、精密組裝的策略，結(jié)合嚴(yán)格的多輪質(zhì)控驗證，我們確保了在每一個環(huán)節(jié)的準(zhǔn)確無誤。最終，我們僅僅用了1個月成功合成了全長 9kb 的高重復(fù)基因，并經(jīng)測序驗證，序列完全正確，無任何突變或缺失，客戶可直接用于下游表達(dá)實驗。

3.“重復(fù)序列”為何是合成噩夢

簡單來說，重復(fù)序列就是指在DNA鏈上多次出現(xiàn)的、相同或高度相似的堿基模式。它就像一篇文章中反復(fù)出現(xiàn)的、完全相同的長句或短語。在本案例中，我們主要應(yīng)對兩種類型：

短重復(fù)序列：通常指6-15個堿基的重復(fù)，它們會影響DNA合成時引物的特異性結(jié)合。

長重復(fù)序列：通常指15個堿基以上的重復(fù)，它們是基因組裝過程中最主要的“攪局者”。

為何重復(fù)序列如此難以合成？

• 引物定位錯誤，導(dǎo)致PCR失?。涸诤铣蛇^程中，我們需要利用引物作為“定位器”來擴增或組裝DNA片段。當(dāng)序列中存在大量重復(fù)時，引物無法找到唯一的位置進(jìn)行結(jié)合，可能會錯誤地結(jié)合到多個相似的位點。這會導(dǎo)致擴增出錯誤的、長短不一的產(chǎn)物，甚至完全無法擴增目標(biāo)片段。
• 組裝過程中的錯配：基因合成通常是將短片段像拼圖一樣一步步組裝起來。如果多個拼圖碎片看起來一模一樣，組裝系統(tǒng)就會“犯糊涂”，無法判斷哪一塊應(yīng)該拼在哪個位置。長重復(fù)序列會導(dǎo)致DNA片段在組裝時發(fā)生錯配和重組錯誤，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)混亂的最終產(chǎn)物。
• 聚合酶的“打滑”現(xiàn)象：DNA聚合酶在復(fù)制重復(fù)序列時，容易發(fā)生“鏈滑動”。它可能在重復(fù)區(qū)域“迷路”，導(dǎo)致堿基的插入或缺失，從而引入突變，使得最終序列與設(shè)計要求不符。
• 形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)：重復(fù)序列自身容易折疊形成發(fā)夾、莖環(huán)等穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)會物理性地阻礙合成酶的推進(jìn)，使得合成反應(yīng)效率低下甚至中斷。
• 正是這些因素相互疊加，使得高重復(fù)序列的合成變得舉步維艱，通常需要反復(fù)試錯、耗時漫長。

4.以技術(shù)實力，兌現(xiàn)交付承諾

這個9kb超高重復(fù)基因項目提前交付，不僅僅是一個速度的紀(jì)錄，更是我們序列設(shè)計能力、合成平臺效率與項目執(zhí)行經(jīng)驗的集中體現(xiàn)。泓迅生物提供從密碼子優(yōu)化、基因合成到載體構(gòu)建、