在生物醫(yī)藥研發(fā)的浪潮中，重組蛋白作為核心生物試劑，其高效表達(dá)始終是科研與產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵瓶頸。原核系統(tǒng)（尤其是大腸桿菌）以其成本低、周期短、操作便捷的優(yōu)勢成為首選平臺。然而，在追求高產(chǎn)量、高活性、可溶性蛋白的道路上，科研人員常常遭遇一系列技術(shù)“攔路虎”。本文將梳理原核蛋白表達(dá)中的常見難題，并闡述泓迅生物如何通過AI密碼子優(yōu)化技術(shù)提供高效解決方案。

1. 原核表達(dá)系統(tǒng)的概述

在原核生物中，外源基因被克隆到一個表達(dá)載體上，并被轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)載體包含了啟動子、起始密碼子、編碼區(qū)、終止密碼子和終止子等序列元素，它們一起協(xié)作使得外源基因能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)被翻譯出來?？梢詷?gòu)建人工載體，并將它們導(dǎo)入大腸桿菌等被廣泛研究的細(xì)菌中，以制備重組蛋白。

優(yōu)勢&局限：

該系統(tǒng)具有高表達(dá)水平、簡單易操作、表達(dá)后產(chǎn)物不含糖基化修飾等優(yōu)勢。同時，原核生物的生長速度也非?？欤瑥亩梢源笠?guī)模制備蛋白。但是原核生物無法進(jìn)行復(fù)雜的翻譯修飾，因此不能用于表達(dá)需要糖基化或者復(fù)雜修飾的蛋白。

應(yīng)用范圍：

原核表達(dá)系統(tǒng)可以用于表達(dá)許多不需特殊修飾的蛋白，如細(xì)胞生長因子、抗原、重組蛋白等，被廣泛應(yīng)用于蛋白純化、分子免疫學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等領(lǐng)域。同時，它也是研究新型藥物的重要平臺。

2. 原核重組蛋白表達(dá)“痛點(diǎn)”解析

設(shè)計階段核心問題

信號肽殘留是新手常見的設(shè)計失誤：真核蛋白的信號肽在原核系統(tǒng)中無法識別，其強(qiáng)疏水性易導(dǎo)致蛋白失活或包涵體形成。所以克隆時務(wù)必切除信號肽，僅保留成熟蛋白序列。

基因序列設(shè)計缺陷同樣高頻發(fā)生：

密碼子問題（稀有密碼子阻滯翻譯、GC含量異常、mRNA二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜）可通過密碼子優(yōu)化解決；

酶切位點(diǎn)選擇不當(dāng)（如NcoI位點(diǎn)致移碼）需謹(jǐn)慎設(shè)計酶切位點(diǎn)位置；

蛋白特性忽視（<10 kDa小蛋白易降解、>100 kDa大蛋白折疊難、疏水區(qū)聚集）需結(jié)合促溶標(biāo)簽（如SUMO/MBP）或分段表達(dá)策略。

表達(dá)階段的典型問題

蛋白不表達(dá)或表達(dá)量低

基因序列中的稀有密碼子（尤其富含精氨酸Arg、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、脯氨酸Pro的基因）、復(fù)雜的mRNA二級結(jié)構(gòu)阻礙核糖體行進(jìn)、啟動子強(qiáng)度不足、宿主菌株的tRNA庫不匹配。

蛋白形成包涵體

重組蛋白在胞內(nèi)高濃度快速表達(dá)時折疊錯誤、分子伴侶輔助不足、疏水區(qū)域暴露導(dǎo)致不可溶性聚集。

?  蛋白降解

宿主內(nèi)源蛋白酶活性高、蛋白自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（特別是N端不穩(wěn)定氨基酸）、缺乏必要的翻譯后修飾保護(hù)。

?  純化困難

宿主雜蛋白多、目的蛋白與分子伴侶或核酸共沉淀、親和標(biāo)簽（如His-tag）掩蔽或去除效率低、非特異性結(jié)合。

?  SDS-PAGE條帶異常

意料外的翻譯后修飾（雖在原核中較少，但存在）、復(fù)性不完全導(dǎo)致聚集或多聚體、蛋白異常電荷分布、降解碎片。

?  宿主菌毒性反應(yīng)

表達(dá)的外源蛋白對宿主細(xì)胞具有毒性、誘導(dǎo)劑濃度過高或誘導(dǎo)時間過長。

重組蛋白表達(dá)不是一蹴而就的事情，任何一種方案不會適用于所有案例，因此蛋白表達(dá)需要不同的應(yīng)對策略。

3. 破局之鑰：密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化是解決源頭性問題的核心策略之一。泓迅生物作為AI賦能的合成生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者，推出了 NG Codon 2.0 AI 密碼子優(yōu)化技術(shù)平臺，提供專業(yè)的基因序列優(yōu)化服務(wù)，改變表達(dá)宿主菌株、調(diào)整表達(dá)條件（如溫度、培養(yǎng)基組分等）等方法來提高可溶性蛋白的表達(dá)水平。

攻克“低表達(dá)/不表達(dá)”：

對基因序列進(jìn)行宿主偏好性密碼子優(yōu)化。徹底消除稀有密碼子，替換為大腸桿菌高表達(dá)頻率的同義密碼子，確保tRNA的充足供應(yīng)和核糖體翻譯的流暢性。同時，算法優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu)，最小化可能阻礙翻譯起始和延伸的穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，顯著提升翻譯效率。

緩解“包涵體”形成：

密碼子優(yōu)化不僅解決“有沒有”的問題，更關(guān)注“快不快”和“好不好”。通過調(diào)控密碼子的使用偏好，可適度降低特定區(qū)域（如富含脯氨酸、精氨酸的區(qū)域）的翻譯速率，給予新生肽鏈更充分的折疊時間，減少因翻譯速度過快導(dǎo)致的錯誤折疊和聚集。優(yōu)化后的序列更易獲得正確折疊的可溶性蛋白。

未經(jīng)密碼子優(yōu)化與密碼子優(yōu)化2.0對比

蛋白R0103，分子量53.48kDa，未優(yōu)化序列分別構(gòu)建于pET-28a（+）載體，采用37℃及16℃兩種條件進(jìn)行異源蛋白表達(dá)，未優(yōu)化的序列未見目的蛋白表達(dá)，經(jīng)過泓迅科技NGTMCodon密碼子優(yōu)化2.0在37℃和16℃均有顯著目標(biāo)蛋白表達(dá)。

原核重組蛋白表達(dá)之路充滿挑戰(zhàn)，但絕非無解之謎。精準(zhǔn)的密碼子優(yōu)化是打通高效表達(dá)“任督二脈”的關(guān)鍵起點(diǎn)。

大腸桿菌蛋白表達(dá)與純化平臺

泓迅生物的大腸桿菌蛋白表達(dá)與純化平臺，充分利用E. coli 的經(jīng)濟(jì)高效和穩(wěn)定性等特點(diǎn)，借助于完備的合成生物學(xué)平臺和高效的NG Codon 2.0 AI密碼子優(yōu)化技術(shù)，為遍布全球的科學(xué)家提供毫克至克級高純度活性蛋白定制服務(wù)。

• 成功率＞95%

• 全面定制化的解決方案

• 免費(fèi)密碼子優(yōu)化

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