CRISPR基因編輯技術(shù)正驅(qū)動著生命科學(xué)研究的革命性進(jìn)展，而其高通量篩選能力—CRISPR文庫篩選更是解鎖基因功能的強(qiáng)大“優(yōu)化器”。然而，構(gòu)建高質(zhì)量、高保真的sgRNA文庫，是整個篩選流程成敗的關(guān)鍵第一步。本文將聚焦這一核心環(huán)節(jié)，介紹Oligo Pools技術(shù)為CRISPR文庫構(gòu)建帶來的質(zhì)控升級，并賦能更廣泛的科研應(yīng)用。

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)

誕生于2012年的CRISPR基因編輯技術(shù)，可能是21世紀(jì)以來生命科學(xué)領(lǐng)域最受關(guān)注的科學(xué)突破。2020年，CRISPR基因編輯技術(shù)獲得諾貝爾獎的認(rèn)可，而在2023年12月，美國FDA批準(zhǔn)了首款基于CRISPR的基因編輯療法上市，用于治療鐮狀細(xì)胞病（SCD）。

CRISPR-Cas9技術(shù)憑借其精準(zhǔn)編輯、操作便捷的特性，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的革命性工具。當(dāng)前研究熱點聚焦于全基因組規(guī)模的功能篩選—通過一次性敲除/激活數(shù)萬個基因，系統(tǒng)性解析腫瘤耐藥性、免疫逃逸、罕見病靶點等關(guān)鍵機(jī)制。

CRISPR文庫篩選

CRISPR文庫篩選是CRISPR/Cas9技術(shù)的一種應(yīng)用。sgRNA的crRNA部分是可定制的組件，可在每個CRISPR實驗中實現(xiàn)特異性。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立目標(biāo)物種的全基因組敲除庫或與特定功能相關(guān)的基因敲除庫，通過功能性篩選和富集及后續(xù)PCR擴(kuò)增和深度測序分析，發(fā)掘與篩選表型相關(guān)的基因，稱為sgRNA文庫篩選。

文庫篩選流程

在構(gòu)建CRISPR篩選文庫的核心流程中，核心組件sgRNA（向?qū)NA）如同“基因?qū)Ш絻x”，其設(shè)計質(zhì)量直接決定篩選成敗。Oligo Pools（寡核苷酸池）技術(shù)作為高通量合成平臺，嚴(yán)格把關(guān)sgRNA序列的覆蓋度、均一性與精準(zhǔn)度，因此Oligo Pools技術(shù)被視為質(zhì)控升級的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

關(guān)鍵挑戰(zhàn)：Oligo Pools 的合成質(zhì)量

傳統(tǒng)引物合成成本高，時間長、效率低。引物池（Oligo Pools）是一種由大量寡核苷酸序列組成的混合溶液，高通量，序列覆蓋率高，并且均一性好。那么，oligo pools合成的準(zhǔn)確性是如何影響CRISPR文庫篩選的最終結(jié)果呢？

1. Oligo Pools合成錯誤率對下游質(zhì)粒的影響：

覆蓋度降低：高錯誤率下，有效（正確）單克隆比例低，導(dǎo)致實際有效深度遠(yuǎn)低于預(yù)期。低頻sgRNA更容易丟失，無法被檢測到。

均一性變差：高錯誤率導(dǎo)致文庫中錯誤分子比例增加。這些錯誤分子擠占了正確分子的份額，尤其使低頻正確分子的實際拷貝數(shù)更低甚至丟失。

后果：不同sgRNA之間的豐度差異變大，平衡性被破壞，影響篩選結(jié)果的解讀。

2. 高錯誤率的文庫質(zhì)粒對病毒包裝的影響

大規(guī)模基因功能篩選下游一般會選用慢病毒，而如果oligo pools文庫的正確率比例偏低，也會影響到病毒顆粒中包含預(yù)期sgRNA占總病毒顆粒的比例。

3. 高錯誤率的文庫質(zhì)粒對篩選結(jié)果的影響

非特異性打靶（假陽性/假陰性干擾）

錯誤的sgRNA隨文庫進(jìn)入細(xì)胞，可能靶向非目標(biāo)基因組位點。

降低目標(biāo)sgRNA的有效深度

錯誤的sgRNA占用感染名額，導(dǎo)致實際進(jìn)入細(xì)胞的 正確sgRNA數(shù)量顯著低于預(yù)期。深度不足會降低低頻sgRNA的檢測靈敏度，影響統(tǒng)計效力。

錯誤率的影響會從文庫構(gòu)建→病毒包裝→細(xì)胞感染→測序分析 逐級傳遞，形成"錯誤累積效應(yīng)"。因此，使用低錯誤率oligo pools是構(gòu)建高質(zhì)量、高可信度CRISPR篩選文庫的關(guān)鍵前提，對基因合成還能大幅降低成本、提高效率。

Oligo Pools：多學(xué)科研究的“合成引擎”

Oligo pools技術(shù)通過高通量、高精度合成sgRNA文庫，為功能基因組篩選、藥物靶點發(fā)現(xiàn)、疾病機(jī)制解析、基因治療優(yōu)化及合成生物學(xué)回路構(gòu)建等關(guān)鍵CRISPR應(yīng)用領(lǐng)域提供核心支撐。除此以外，Oligo pools更憑借大規(guī)模并行合成、高序列覆蓋度的核心優(yōu)勢，成為多領(lǐng)域研究的通用引擎：

突變體庫構(gòu)建

通過Oligo Pools，研究人員能夠合成大量含有不同突變的DNA片段，從而創(chuàng)建突變體庫，用于篩選出具備優(yōu)異功能的蛋白質(zhì)或基因調(diào)控序列。

NGS雜交捕獲探針文庫

NGS建庫時，通過Oligo Pools合成構(gòu)建雜交捕獲探針文庫，既可以用于目的基因的捕獲與檢測,也可以用于篩選靶序列的特異性探針序列。

熒光原位雜交（FISH）

Oligo Pools通過高通量合成，在短時間內(nèi)生成大量的具有不同序列的探針，可以覆蓋目標(biāo)區(qū)域的多個位點，提高FISH檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。

合成生物學(xué)和DNA數(shù)據(jù)儲存

在合成生物學(xué)中，研究人員可以通過Oligo Pools合成DNA片段，并利用DNA拼接技術(shù)將其組裝成更大的DNA結(jié)構(gòu)，快速實現(xiàn)多基因合成或途徑優(yōu)化。此外，隨著DNA儲存技術(shù)的發(fā)展，Oligo Pools的高通量合成能力使其成為DNA數(shù)據(jù)存儲的理想解決方案。

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