雖然桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)不具備哺乳動物細胞的所有翻譯后修飾能力，但它能夠進行一些基本的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化，適合大多數(shù)功能研究和生產(chǎn)應(yīng)用。

酵母表達系統(tǒng)兼具原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點，具有培養(yǎng)條件普通、生長速度快、成本低、可進行蛋白翻譯后加工、易獲得可溶性活性重組蛋白等特點。

巴斯德畢赤酵母因其快速生長、商業(yè)化表達載體豐富和高效分泌表達的優(yōu)點，成為酵母表達重組蛋白的優(yōu)先選擇。

原核蛋白表達系統(tǒng)（如大腸桿菌）具有快速、高產(chǎn)量、經(jīng)濟實惠等優(yōu)勢，適用于大規(guī)模蛋白生產(chǎn)。

可以采用密碼子優(yōu)化、改變表達宿主菌株、調(diào)整表達條件（如溫度、培養(yǎng)基組分等）等方法來提高可溶性蛋白的表達水平。

在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，部分外源蛋白可能會由于錯誤折疊而形成包涵體，主要原因包括外源蛋白的復(fù)雜結(jié)構(gòu)或毒性。

1. 提高蛋白表達量：密碼子優(yōu)化可以顯著提高外源基因在宿主細胞中的表達量，為后續(xù)的分離純化等步驟提供便利。

2. 提高翻譯效率：通過減少稀有密碼子的使用，可以避免翻譯過程中的瓶頸，提高整體的翻譯效率。

3. 改善mRNA穩(wěn)定性：優(yōu)化后的mRNA二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于核糖體的結(jié)合和翻譯過程的順利進行。

為避免脫靶效應(yīng)，可以通過以下幾種方法：

   - 使用高特異性的Cas9變體。

   - 精確設(shè)計引導(dǎo)序列以盡量減少與非目標序列的相似性。

   - 在設(shè)計sgRNA時使用生物信息學工具預(yù)測潛在的脫靶位點并進行優(yōu)化。

通過對sgRNA進行化學修飾（如在2'-OH位點進行修飾）可以提高其穩(wěn)定性和活性。此外，優(yōu)化sgRNA的設(shè)計以減少脫靶效應(yīng)也有助于提高其效率。

特異性：確保siRNA序列特異性靶向目標基因，避免脫靶效應(yīng)。

有效性：篩選具有高沉默效率的siRNA序列。

穩(wěn)定性：優(yōu)化siRNA序列以提高其在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性和有效性。

qPCR：定量檢測目標基因mRNA水平的變化。

Western Blot：檢測目標基因編碼蛋白質(zhì)的表達水平。

熒光顯微鏡：通過熒光標記觀察siRNA或shRNA在細胞中的分布和表達。

選擇RNA聚合酶時，根據(jù)DNA模板上的啟動子序列選擇相應(yīng)的酶，如T7 RNA聚合酶適用于T7啟動子，T3 RNA聚合酶適用于T3啟動子，SP6 RNA聚合酶適用于SP6啟動子。